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可分離式NHS活化磁珠

胺基基團(tuán)（-NH2）是固定蛋白質(zhì)分子最常見(jiàn)功能基團(tuán)：該基團(tuán)可以在每個(gè)多肽鏈（稱(chēng)為α-胺）的N末端和賴(lài)氨酸（Lys，K）殘基（稱(chēng)為ε-胺）的側(cè)鏈中找到。由于伯胺基團(tuán)在生理?xiàng)l件下帶正電荷，因此它們通常分布在蛋白質(zhì)的外部（即在外表面）；所以在與它們結(jié)合過(guò)程中，不會(huì)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變性。

BcMag ? 可分離式NHS活化磁珠是均勻的，表面涂有高密度NHS（N-羥基琥珀酰亞胺）官能團(tuán)的磁珠。磁珠利用可靠的NHS酯進(jìn)行化學(xué)固定，不需要使用危險(xiǎn)化學(xué)品。而且本磁珠具有較低的非特異性結(jié)合率，并且不會(huì)造成偶聯(lián)配體的泄漏。通過(guò)形成穩(wěn)定的酰胺鍵，偶聯(lián)效率超過(guò)85%，該磁珠可以快速，有效地共價(jià)結(jié)合任何含伯胺的配體。Bioclone 可分離式NHS活化磁珠反應(yīng)僅需不到一個(gè)小時(shí)（在室溫pH 7-9下為15-30分鐘，在4°C下為4小時(shí)），就可以產(chǎn)生非常穩(wěn)定的連接。由于NHS基團(tuán)通過(guò)內(nèi)置的可切割二硫鍵連接物（圖1）與磁珠連接，因此，可用還原劑（如DTT或β-巰基乙醇）從磁珠上切割并分離出目標(biāo)分子-配體的復(fù)合物。此外，它的親水性表面基團(tuán)保證了磁珠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，具有極低的非特異性吸附率、且有良好的分散性，并易于在各種緩沖液中處理。

產(chǎn)品獨(dú)特的干燥狀態(tài)避免了丙酮溶劑儲(chǔ)存的麻煩，或液體去除和處理的需要。此外，由于干基質(zhì)在膨脹時(shí)濃縮樣品，減少了起始材料的體積，并且會(huì)提高配體固定化的效率，因此它非常適合與濃度較低樣品進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。

 工作流程

本磁珠作為固體載體可以完美地用于各種親和純化，將分子，細(xì)胞和部分細(xì)胞進(jìn)行純化。只需要與配體結(jié)合后，將磁珠添加到含有目標(biāo)分子的溶液中，然后混合，孵育，清洗和洗脫目標(biāo)分子（圖2）

圖2

特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)：

l 預(yù)活化，即用型磁珠

l 含有一個(gè)可切割的內(nèi)置二硫鍵，可將配體-目標(biāo)分子復(fù)合物從磁珠中分離出來(lái)。

l 配體-目標(biāo)分子復(fù)合物可以從磁珠上分離出來(lái)

l 便于使用

l 在pH7.4，4℃-25℃條件下可以快速偶聯(lián)

l 穩(wěn)定的共價(jià)鍵，低水平的配體泄漏 

l 可重復(fù)使用的免疫親和基質(zhì)           

l 極低的非特異性結(jié)合率 

l 可固定15-20ug蛋白/mg的磁珠 

l 用途：用于純化抗體，蛋白質(zhì)/肽，DNA / RNA;細(xì)胞篩選、免疫沉淀

操作協(xié)議

提示：

l 強(qiáng)烈建議在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行滴定優(yōu)化，以確定每個(gè)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的磁珠數(shù)量。該協(xié)議可以相應(yīng)地放大和縮小。

l 避免使用含有還原劑、tris或其他含有伯胺或其他親核類(lèi)試劑的緩沖液，因?yàn)樗鼈儠?huì)破壞二硫鍵連接物或與預(yù)期的偶聯(lián)反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)。但wash buffers和 storage buffers 可含有氨基或羧基成分。

A.所需耗材

1.磁力分離器（適用于手動(dòng)操作）：根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)生物樣品的體積，使用者可以選擇一下不同型號(hào)的磁力分離器：

BcMag? separator-2可以容納兩個(gè)單獨(dú)的1.5 ml離心管(Cat.# MS-01);

BcMag? separator-6可以容納六個(gè)單獨(dú)的1.5 ml離心管(Cat.# MS-02);

BcMag? separator-24可以容納24個(gè)單獨(dú)的1.5-2.0 ml離心管(Cat.# MS-03);

 BcMag? separator-50可以容納一個(gè)單獨(dú)的50 ml離心管，一個(gè)15ml的離心管，以及四個(gè)1.5ml離心管(Cat.# MS-04);

BcMag? separator-96 可以配合96 ELISA板使用 (Cat.#MS-05).

2.Coupling Buffer: 0.1M磷酸鉀，0.15 M NaCl，pH 7.4 

3.Wash Buffer: 0.05 M Tris-HCl, 0.5 M NaCl, pH 8.0.

4. Blocking Buffer: 1 M乙醇胺, pH 9.0

B.磁珠的準(zhǔn)備

1.用丙酮（30 mg/ml）制備3%的磁珠，并充分混合。

提示：將未使用的磁珠可以在丙酮溶液中，儲(chǔ)存在4℃。可保存一年時(shí)間。

2.將100μl（3mg）的磁珠轉(zhuǎn)移到離心管中。

3. 將試管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全沉淀時(shí)，去除上清液。從磁力分離器上取下試管，加入1ml的coupling buffer用通過(guò)渦旋30秒重新懸浮磁珠。

4.重復(fù)步驟3 兩次。

5.去除上清液，將清洗的磁珠準(zhǔn)備進(jìn)行耦合反應(yīng)。

注：使用coupling buffer重新水化后，由于官能團(tuán)的穩(wěn)定性，應(yīng)盡快使用磁珠。

C.蛋白質(zhì)的偶聯(lián)

提示：NHS活化磁珠的偶合效率因配體而異。用戶(hù)可應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化配體的濃度。蛋白質(zhì)的建議結(jié)合濃度為0.5-10 mg/ml。對(duì)于小分子多肽，配體濃度應(yīng)至少為200μmol /ml。

1.用coupling buffer制備100μl蛋白質(zhì)溶液（0.5-1mg/ml）或多肽溶液（200μmol/ml）并與上述清洗過(guò)的磁珠混合。如果樣品已經(jīng)懸浮在另一個(gè)緩沖液中，用等量的coupling buffer稀釋樣品。

 2. 在室溫條件下，連續(xù)旋轉(zhuǎn)孵育4-6小時(shí)或者過(guò)夜。提示：使用者應(yīng)該對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化

 3.將試管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全沉淀時(shí)，去除上清液。從磁力分離器上取下試管，加入1ml的coupling buffer用通過(guò)渦旋30秒重新懸浮磁珠；再將試管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全沉淀時(shí)，去除上清液。

4.用1ml的Washing buffer(或者 1 M NaCl)清洗磁珠，重復(fù)3-4次。

 5. 向磁珠中添加0.5-1ml的blocking buffer(BSA也可以封閉磁珠, PBS, pH7.4, 0.1%BSA)，并在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)或在4°C下過(guò)夜。

 6. 用1ml預(yù)冷的Washing buffer將磁珠洗滌3次。

 7. 用 pH 7.4含有0.1% BSA，0.01%疊氮化物（w/v）的PBS緩沖液重新懸浮磁珠至所需濃度，并在4℃下儲(chǔ)存，直至使用。不要冷凍保存。

D．常見(jiàn)親和純化過(guò)程

提示：

l 該方案是一個(gè)通用的親和純化發(fā)法。因?yàn)闆](méi)有兩種蛋白質(zhì)是完全相同的，所以不可能為所有的蛋白質(zhì)純化設(shè)計(jì)一個(gè)通用的協(xié)議。為了獲得最佳結(jié)果，每個(gè)用戶(hù)必須確定純化單個(gè)目標(biāo)蛋白的最佳工作條件。

l 避免在binding buffers 和 washing buffers中使用還原劑。

l 強(qiáng)烈建議根據(jù)粗樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)的含量，進(jìn)行滴定，以?xún)?yōu)化每個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)   

中使用的磁珠數(shù)量。使用過(guò)多的磁珠將導(dǎo)致較高的背景，而使用過(guò)少的磁珠將導(dǎo)致較低的產(chǎn)量。每毫克磁珠通?？膳c1-20μg靶蛋白結(jié)合。

1.將適量的珠子轉(zhuǎn)移到離心管中。將管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全沉淀時(shí)，去除上清液。

2. 取下試管，加入5倍磁珠溶液體積的PBS緩沖液，通過(guò)震蕩重新懸浮磁珠，渦旋30

秒。將試管至于室溫環(huán)境1-3分鐘，再將管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全

沉淀時(shí)，去除上清液。

3.重復(fù)步驟2 兩次。

4. 向含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的粗樣品中添加洗滌過(guò)的磁珠，并在室溫或所需溫度下溫浴1-2小

時(shí)（溫度越低，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)）。

提示：強(qiáng)烈建議進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)以?xún)?yōu)化培養(yǎng)時(shí)間。因?yàn)榉趸臅r(shí)間太長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致很高的背景。

5. 用5倍磁珠體積的PBS緩沖液或1M NaCl徹底清洗磁珠，直到280nm處洗脫液的吸光度接近背景水平（OD 280<0.05）。

    提示：添加更高濃度的鹽、非離子洗滌劑和還原劑也可能會(huì)降低非特異性背景。例如，向洗滌緩沖液中添加NaCl（濃度為1-1.5 M）、0.1-0.5%的非離子洗滌劑，如Triton X-100或Tween-20，以及還原劑，如DTT或TCEP（我們通常使用3mM）。

6. 通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ǎ绲?/span>pH（2-4）、高pH（10-12）、高鹽、高溫、親和洗脫或SDS-PAGE加載緩沖液中煮沸，洗脫目標(biāo)蛋白。

7.切斷二硫鍵

提升：由于配體之間的構(gòu)象不同，用戶(hù)應(yīng)確定最佳工作條件，如還原劑、pH值和溫度，以切割單個(gè)配體的二硫鍵。以下是從磁珠上切割共軛的GFP蛋白的示例。

1）在140 mMβ-巰基乙醇或5 mM DTT（二硫蘇糖醇）中孵育磁珠（30mg/ml）。

a. 在 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 140 mM β-巰基乙醇條件下，室溫2小時(shí)或

者過(guò)夜孵育，或者在98℃條件下5分鐘。

b. 在100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 5mM DTT條件下，室溫2小時(shí)或者過(guò)夜孵

育，或者在98℃條件下5分鐘。